Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
В данном общем разделе в качестве стандартного метода описывается метод ПЦР. Могут применяться и альтернативные методы, если они выдерживают требования к качеству, перечисленные ниже.
2. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
В данном разделе устанавливаются требования к подготовке образца, к амплификации in vitro последовательностей ДНК и к детектированию специфического продукта ПЦР. С помощью ПЦР могут быть детектированы определенные последовательности ДНК. Последовательности РНК могут также быть детектированы путем обратной транскрипции РНК на комплементарную ДНК (cDNA) с последующей амплификацией.
3. ПРИНЦИП МЕТОДА
ПЦР представляет собой процедуру, позволяющую производить в условиях in vitro амплификацию сегментов ДНК или РНК (после обратной транскрипции на cDNA).
После денатурации двунитевой ДНК в однонитевую два синтетических оли-гонуклеотидных праймера противоположной полярности спариваются с их соответствующими комплементарными последовательностями в подлежащей амплификации ДНК. Короткие двунитевые участки, формирующиеся в результате специфического спаривания оснований праймеров и комплементарной ДНК-последовательности, образуют границы амплифицируемого сегмента ДНК и служат начальными точками для синтеза ДНК in vitro с участием термостабильной ДНК-полимеразы.
Процесс амплификация ДНК состоит из циклов, включающих:
- тепловую денатурацию нуклеиновой кислоты (последовательности-мишени) на две отдельные нити;
- специфический отжиг последовательности-мишени с праймерами в подходящих реакционных условиях;
- наращивание праймеров, присоединенных к обеим отдельным нитям, под воздействием ДНК-полимеразы при подходящей температуре (синтез ДНК).
Повторяющиеся циклы тепловой денатцурации, отжига с праймерами и синтеза ДНК приводят к экспоненциальной амплификации сегмента ДНК, ограниченного праймерами.
Специфический продукт ПЦР, называемый ампликоном, может быть определен разнообразными методами соответствующей специфичности и чувствительности.
4. ИСПЫТУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ
В связи с высокой чувствительностью ПЦР, образцы должны быть оптимальным образом защищены от попадания извне последовательностей-мишеней. Отбор проб, хранение и транспортировку испытуемого материала производят в условиях, минимизирующих деградацию последовательности-мишени. В случае проведения испытания на РНК-последовательности, необходимо принять особые меры предосторожности ввиду высокой чувствительности РНК к деструктивному воздействию рибонуклеаз. Следует учитывать, что некоторые добавляемые реагенты, например, антикоагулянты или консерванты, могут оказывать влияние на ход определения.
5. МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ
5.1. Предотвращение загрязнения
В связи с риском загрязнения следует строго разграничивать рабочие зоны в зависимости от используемых материалов и применяемой технологии. Учитываемые факторы включают передвижение персонала, использование спецодежды, перемещение материалов, подачу воздуха и процедуры деконтаминации.
Систему следует разделить на такие отсеки, как:
- зона основной смеси (зона, в которой работы осуществляются только с материалами, не содержащими шаблонных последовательностей, например, праймерами, буферными растворами и т.д.),
- пре-ПЦР (зона, в которой ведется работа с реагентами, образцами и контроля-ми),
- ПЦР-амплификация (амплифицируемый материал содержится в закрытой системе),
- пост-ПЦР детектирование (единственная зона, в которой операции с амплифи-цируемым материалом производятся в открытой системе).
5.2 Подготовка образцов
При подготовке образцов подлежащая амплификации последовательность-мишень должна быть эффективным и воспроизводимым образом экстрагирована или высвобождена из испытуемого материала так, чтобы амплификация в избранных реакционных условиях была осуществима. Могут быть использованы различные физико-химические процедуры экстракции и/или обогащения.
Добавки, присутствующие в испытуемом материале, могут оказывать влияние на ход ПЦР. Для контроля присутствия ингибиторов в испытуемом материале следует провести процедуры, описанные в пункте 7.3.2.
В случае РНК-матриц следует уделять внимание предотвращению проявления рибонуклеазной активности.
5.3 Амплификация
Амплификация последовательности-мишени методом ПЦР проводится в оптимизированных циклически изменяющихся условиях (температурный профиль для денатурации двунитевой ДНК, отжига и наращивания праймеров; периоды инкубации при выбранных температурах; скорость наращивания). Эти условия зависят от различных параметров, например:
- длины и состава праймера и последовательности-мишени;
- типа ДНК-полимеразы, буферной смеси и реакционного объема, используемых при амплификации;
- типа используемого устройства для термоциклирования и скорости передачи тепла между аппаратом, реакционным сосудом и реакционной жидкостью.
5.4 Детектирование
Ампликон, образовавшийся в результате ПЦР, может быть идентифицирован по размеру, последовательности, путем химической модификации или комбинацией этих методов. Характеризация по размеру может быть проведена методами гель-электрофореза (с использованием слоев агарозного или полиакриламидного гелей или капиллярного электрофореза) или колоночной хроматографии (например, ВЭЖХ). Характеризация по составу последовательности может быть проведена путем специфической гибридизации зондов, содержащих последовательность, комплементарную мишени, или расщеплением амплифицированного материала, отражающим наличие мишень-специфических сайтов ферментативной рестрикции. Характеризация по химической модификации может быть проведена, например, введением в ампликоны флуорофора с дальнейшей детекцией флуоресценции, возникающей в результате возбуждения.
